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PCR und Sequenzierung. Zwei Methoden die man bislang vielleicht mal in der Schule gehört hatte und ansonsten Fachpersonal vorbehalten waren, sind längst in aller Munde. Doch wie funktionieren diese eigentlich und wie ist es möglich tausende Proben in kurzer Zeit zu analysieren? In den Sammlungen des Deutschen Museums sind einige Objekte vertreten, die den technischen Fortschritt dieser zwei Labormethoden veranschaulichen. Einige davon werden bald wieder in der Ausstellung zur Nano- und Biotechnologie zu sehen sein.

Winzige DNA-Spuren vermehren

DNA in kleinsten Mengen muss für fast alle Anwendungen erstmal vermehrt werden. Dies geschieht mit Hilfe der PCR, der Polymerasekettenreaktion. Erfunden wurde diese Methode von dem Biochemiker Kary Mullis im Jahr 1985. Diese Entdeckung war so bedeutend, dass sie 10 Jahre später mit dem Nobelpreis für Chemie gekrönt wurde.

Für eine PCR-Reaktion benötigt man die zu vervielfältigende DNA, Nukleotide, also die vier Bausteine der DNA (Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin), Primer („Start-Stückchen“), das ausführende Enzym DNA-Polymerase und etwas Puffer, damit das Enzym gut arbeiten kann. Eine PCR-Reaktion besteht aus drei Schritten, die bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt werden. Zunächst erfolgt die sogenannte Denaturierung der DNA. Die beiden DNA-Stränge werden bei hohen Temperaturen von etwa 95°C in zwei Einzelstränge aufgeschmolzen. Danach wird die Temperatur gesenkt und die sogenannten Primer kommen zum Einsatz. Dies sind kurze Oligonukleotide  (Mini DNA-Stückchen), die bestimmen, welches Stück DNA vermehrt wird. Im Labor kann man diese Stückchen vorher definieren und passgenau synthetisieren lassen. Die Primer liegen rechts und links von dem zu vermehrenden Stück DNA und lagern sich bei einer spezifischen Temperatur an. Nach diesem sogenannten Annealing wird die Temperatur wieder auf 72°C erhöht. Die DNA-Polymerase knüpft nun an die Primer passende Nukleotide an um den DNA-Strang zu verlängern. Aus einem Strang als Ausgangsmaterial werden so zwei neue DNA-Stränge. Nun ist natürlich nach einer Runde DNA-Amplifikation immer noch nicht genug DNA vorhanden und der Zyklus geht in eine neue Runde, die wieder mit dem Aufschmelzen der DNA bei 95°C beginnt. Nach etwa 25-30 Zyklen hat man genug DNA für weitergehende Arbeiten zusammen.

Was waren nun die Meilensteine im weiteren technischen Fortschritt?

Eine PCR-Reaktion durchzuführen war zunächst etwas mühselig. Zum einen musste man die Probe alle paar Minuten in ein anders temperiertes Becken setzen. Zum anderen ging die DNA-Polymerase nach jedem Zyklus kaputt, wenn wieder der Denaturierungsschritt durchgeführt wurde. Normale Enzyme halten Temperaturen von 95°C nämlich nicht aus. Durchbruch war hier der Einsatz von Taq-Polymerase, die aus dem zuvor schon entdeckten hitzestabilen Bakterium Thermus aquaticus stammt. Das Bakterium ist in Geysiren heimisch, seine Enzyme sind also für hohe Temperaturen geeignet. Weiterhin gab es bald PCR-Geräte, die einen Metallblock mit Proben schnell heizen und kühlen konnten. Somit reichte es die Proben in das Gerät zu stellen und später wieder abzuholen.

Für Diagnostik und Forschung

Die Anwendungsmöglichkeiten der PCR sind extrem vielfältig: Während man im Forschungslabor oft das gewünschte Gen einfach nur für weitere Anwendungen vervielfältigen will, eignet sich ein PCR-Test auch für Diagnostik von Erbkrankheiten, Vaterschaftstests, Anwendungen in der Gerichtsmedizin und nicht zuletzt zur Diagnostik von Infektionskrankheiten. Besonders in der Diagnostik hat man manchmal nicht DNA sondern RNA als Ausgangsmaterial vorliegen. Dann muss die RNA in einem ersten Schritt mit dem Enzym Reverse Transkriptase in DNA umgeschrieben werden. Danach kann sie zum Nachweis einer Infektion vervielfältigt werden.

Mit Wiedereröffnung des DNA-Besucherlabors zusammen mit dem ersten Realisierungsabschnitt des Museums werden unsere Gäste wieder die Möglichkeit haben einmal selbst eine PCR durchzuführen und die vermehrten DNA-Stücke über ein Gel abschließend auszuwerten.

DNA-Fragmente lesen lernen

Die per PCR vervielfältigten Fragmente lassen sich nun wie gesagt auf vielfältige Weise weiterverwenden – zum Beispiel für eine Sequenzierung. Dies bedeutet man entschlüsselt ganz genau die Basenabfolge der Bausteine auf der DNA. Zunächst einmal wollten Forschende einfach nur herausfinden, wie viele Gene verschiedene Organismen haben und welche Funktionen die einzelnen Gene innehaben. Kennt man dann die normale Sequenz eines Gens, lassen sich so per Vergleich Mutationen herausfinden. Oder man vergleicht Gene um herauszufinden ob zwei Organismen miteinander verwandt sind.

Wenn von Sequenzierung die Rede ist, meint man zumeist die 1975 entwickelte und nobelpreisgekrönte Methode der Kettenabbruch-Reaktion, nach dem Entwickler Frederick Sanger auch oft „Sanger-Sequenzierung“ genannt. Bei der Sanger-Methode wird die DNA zunächst durch hohe Temperaturen wie bei der PCR in Einzelstränge denaturiert. Anschließend lagert sich, ebenfalls wie bei der PCR, ein Primer an einen Einzelstrang an und bildet den Start für den Anbau weiterer Nukleotide. Es gibt jeweils vier parallele Reaktionsansätze, da es vier verschiedene Bausteine, die Nukleotide, gibt. Jeweils ein Nukleotid pro Ansatz ist dabei so modifiziert, dass nach dessen Einbau kein weiteres Nukleotid mehr angebaut werden kann – es entsteht der „Kettenabbruch“. Im Resultat erhält man unterschiedlich lange DNA-Stücke, die durch eine Gelelektrophorese der Größe nach aufgetrennt werden.  Durch radioaktive Markierung weiß man, welches Nukleotid jeweils das letzte im DNA-Stück ist und kann daraus die gesamte Sequenz der untersuchten DNA ableiten.

Schätze in unserem Depot

Die Sammlungen des Deutschen Museums beinhalten eine eindrucksvolle Auswahl an Geräten, die den Weg vom selbstgebauten Prototyp bis hin zur Hochleistungsmaschine aufzeigt.

1986 behalf man sich mit selbstgebauten Elektrophoresekammern aus zusammengeklammerten Glasplatten. Zwischen diese Platten goss man ein Gel, auf dem die in der Sequenzierreaktion hergestellten DNA-Fragmente dann der Größe nach aufgetrennt wurden. So erhielt man ein Bandenmuster, aus dem man die Sequenz des untersuchten DNA-Fragments ablesen kann.

Ähnliche Kammern waren bald auch schon kommerziell erhältlich, wie diese Kammer von 1989. Die integrierte Kühlung sorgte dafür, dass sich das Gel während der Elektrophorese weniger aufheizte. Dies führte zu kompakterem Bandenmuster und somit wiederum zu einer verlässlicheren Auswertung der Sequenz.

Ein Manko hatten die Kammern bis dahin: Die in der Reaktion verwendeten Nukleotide mussten radioaktiv markiert sein. Der Einsatz von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden machte dieses Problem obsolet. Zunächst wurden alle vier Nukleotide mit dem gleichen Fluoreszenzfarbstoff markiert, aber schon bald nutzte man unterschiedliche Farbstoffe je Nukleotid. Vorteil hier wiederum: Man spart sich Reaktionsansätze, da pro Probe nur mehr ein Reaktionsgefäß und nicht mehr vier benötigt werden. Die verschiedenfarbige Fluoreszenz zeigt nicht nur an ob während der Sequenzierung ein Nukleotid eingebaut wurde, sondern auch gleich welches.

Der Einsatz von fluoreszierenden Nukleotiden war zwar ein gewaltiger Fortschritt, reichte aber immer noch nicht aus um große Projekte wie die Sequenzierung der gesamten DNA des Menschens, des humanen Genoms, durchzuführen. Hier kamen dann sogenannte Kapillarsequenzierer zum Einsatz. Der ABI-Prism-3700-DNA-Sequenzierer hat 96 Kapillaren, in die die DNA-Proben eingespritzt werden. Bestückt mit insgesamt bis zu 384 vorbereiteten Proben, die nacheinander eingespritzt werden kann das Gerät 24h automatisch laufen und diese Proben sequenzieren. Zur Sequenzierung des menschlichen Genoms waren etwa 300 dieser Geräte im Einsatz.

Doch auch diese Technik ist inzwischen schon wieder überholt. Ein Highlight unserer Sammlung ist der „Genome Sequencer“ der mit einer Sequenzierungsmethode der sogenannten zweiten Generation arbeitet. Diese sogenannte Pyrosequenzierung funktioniert folgendermaßen: Die in Einzelsträngen vorliegenden unbekannten DNA-Stücke werden im Gerät sukzessive zu Doppelsträngen ergänzt. Dabei werden die eingebauten Bausteine nacheinander über die Probe gespült. Bindet ein Baustein, dann wird ein Lichtblitz von der Kamera registriert. Man erhält pro Lauf eine Sequenzierung von bis zu 20 Millionen Bausteinen.

Zwei weitere Hochdurchsatzgeräte kamen letztes Jahr ins Haus und schlummern noch in unserem Depot. Bei ersterem handelt es sich um einen Genome Analyzer II von Illumina von 2009. Er bringt ein paired-end Modul mit, das es ermöglicht, die gewünschten DNA-Stränge nicht nur von einer sondern von beiden Seiten zu sequenzieren. Dies erleichtert die anschließende bioinformatische Auswertung. Das direkte Nachfolgemodell ist die Illumina HiSeq2500 Maschine von 2012, ebenfalls mit der Möglichkeit für paired-end-Läufe. Dieses Gerät sequenziert ein Genom an einem Tag durch. Die Sequenzierung selbst findet nicht in Reagenzgefäßen oder Lochplatten statt, sondern auf kleinen Glasplatten, den sogenannten flow cells, den Fließzellen. Der Illumina HiSeq2500 birgt ein Epifluoreszenzsystem mit vier Kameras in sich. Dieses detektiert die in der Sequenzierreaktion eingebauten fluoreszenzmarkierten Nukleotide und zeigt abschließend die Sequenz des untersuchten DNA-Abschnitts an.

Genome in Datenbanken

Der enorme Fortschritt auf dem Bereich der Sequenzierung hat dazu geführt, dass inzwischen knapp 80000 Genome von Pflanzen, Tieren, Bakterien und Viren sequenziert worden sind. Die Genome sind abgelegt in Datenbanken und für jeden frei zugänglich. Die schnellen Maschinen von heutzutage machen es möglich, kleinere Genome innerhalb kürzester Zeit zu sequenzieren, was gerade in der aktuellen Situation sehr hilfreich ist. Bleiben wir gespannt, welche Fortschritte im Bereich von Sequenzierung und PCR in Zukunft noch auf uns warten.

An dieser Stelle noch ein herzliches Dankeschön an unser Photoatelier sowie an das Sammlungsmanagement in der Objektannahme für die schönen Exponatfotos, die in den letzten Jahren angefertigt wurden!

Autor/in

Margherita Kemper

Ist promovierte Biologin und zuständig für den Bereich Life Sciences. Dies umfasst nicht nur die spannende Sammlung an Laborgeräten sondern auch die Leitung des DNA-Besucherlabors im Zentrum Neue Technologien. Hier können Interessierte selbst an Laborgeräten unter Anleitung experimentieren und PCR, DNA-Isolation und Antigentests kennenlernen.

Ihr Tipp für einen Museumsbesuch: Ein Besuch der Altamira-Höhle! Die steinzeitlichen Wandmalereien von Bisons und Hirschkühen fand sie schon als Jugendliche so spannend, dass sie in der Oberstufe ihre Facharbeit darüber schrieb.